珍藏版 史上最全的基因编辑常用技术指南(4)

Cre-loxp系统的优点：
说到这里，大家是不是都觉得Cre-loxp系统是一个非常有趣的工具？Cre-LoxP系统是在神经系统中应用最广泛的条件性基因敲除工具，Cre-loxp系统优点如下：
◉ 高效性：Cre重组酶与具有LoxP位点的DNA片段形成复合物之后，可以提供足够的能力引发之后的DNA重组过程，重组过程简约高效；
◉ 特异性强：LoxP序列的唯一性，保证基因重组的特异性；
◉ 应用范围广：Cre重组酶可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用；
◉ 可由二型启动子启动表达：Cre重组酶的编码基因可由任何一种二型启动子驱动，由此保证Cre重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官或者在不同的发育阶段或不同的生理条件下表达，从而实现较高的组织和细胞特异性。
Cre/loxp系统的应用：
Cre/loxp系统是一种完善的研究工具，由于上述优点而应用广泛，尤其是在转基因小鼠领域。最常见的用途有：
◉ Cre依赖性基因表达：在目标基因上游放置两边都带有loxP位点的终止密码子（通常称为“ lox-stop-lox”或“ LSL”表达盒），在没有Cre重组酶的情况下，将阻止基因表达；在Cre存在的情况下，切除终止密码子，基因表达；
◉ Cre依赖性基因敲除：将loxP位点置于基因的两侧（称为“ floxing”，意为“flanked by loxP”），在Cre不存在时允许基因表达；当Cre存在时该基因表达将被破坏或删除；
◉ 选择标记的去除：在常规的小鼠编辑中，通常使用选择标记进行目标克隆筛选，但是在初始选择过之后，通常希望删除标记。此时通过对选择标记进行floxing处理，利用Cre可轻松执行此操作；
◉ 调节Cre表达：在发育的某些阶段通过将Cre置于特异性启动子下游，或通过将Cre置于诱导启动子（例如强力霉素诱导表达系统），这样Cre重组酶只能在指定的细胞中或指定的时间表达，同时结合上述一些loxP使用方法，可以进行不同要求的基因修饰。
四、CRISPR
CRISPR是细菌免疫系统的重要组成部分，可使细菌记住并破坏噬菌体。在基因编辑应用中，Cas9核酸内切酶通过gRNA序列进行靶向，从而诱导双链断裂。像ZFN和TALENs一样，CRISPR/Cas9也使用HDR，但是使用RNA来指定编辑使得该系统更便宜、更省时、更精确。与TALENs相比，CRISPR的应用更为广泛，每周都会有使用该技术发表的新论文。

CRISPR/Cas9系统有两个不同的组成部分：指导RNA（gRNA）和核酸内切酶，在上图中为Cas9。当在细胞中表达时，gRNA/Cas9复合物通过gRNA之间的碱基配对募集到靶序列及其在基因组DNA中的互补序列。为了使Cas9成功结合到DNA，基因组DNA中的靶序列不仅必须与gRNA序列互补，而且必须紧随其后的是正确的PAM（protospacer adjacent motif）序列。请注意，PAM序列存在于DNA靶序列中，但不存在于gRNA序列中，任何具有正确靶序列且后接PAM序列的DNA序列都将被Cas9结合。不同的cas9蛋白识别的PAM序列不同。

CRISPR/Cas9技术的应用
1. 导致双链断裂：完整功能的CRISPR/Cas酶将根据gRNA序列在特定位置引入双链断裂（DSB）。DSBs优先通过非同源末端连接（NHEJ）在细胞中修复，该机制经常会导致DNA中引物插入或缺失（indels），插入缺失会导致移码功能等位基因缺失。