珍藏版 史上最全的基因编辑常用技术指南(2)
2023-04-08 来源:文库网
三、Cre-Loxp
Cre-loxp是一个非常有趣的工具，该工具可用于在转基因动物、胚胎干细胞和（或）组织特异性细胞类型中创建特定的靶向DNA修饰。现已广泛用于控制基因表达、Cre重组酶在各种启动子的控制下或以其可诱导的形式对基因表达进行复杂的时空控制，尤其是在转基因小鼠研究中的应用尤为广泛。
Cre-loxp系统的组成及原理：
Cre-loxp系统由源自P1噬菌体的两个成分组成：Cre重组酶和loxP识别位点。
Cre重组酶最初命名是因为它“引起重组（ causes recombination）”，后来也称之为“环化重组酶（cyclization recombinase）”，它是一个38 kDa的蛋白质，在loxP识别位点负责分子内和分子间的重组。该系统的主要优势在于Cre的作用不依赖于任何其他辅助蛋白或辅因子，因此可广泛用于各类实验中。
LoxP（(Locus of X(cross)-over in P1）则是位于P1噬菌体中的34bp序列，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成，核心序列的不对称赋予了loxP位点方向性，典型的loxP序列为ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT。loxP序列在除P1噬菌体之外的任何已知基因组中都不是天然存在的，并且由于足够长，几乎没有机会随机出现。因此，在DNA序列感兴趣的位置插入loxP位点可以进行非常特殊的操作。
具体原理：
Cre重组酶介导两个loxP位点之间的位点特异性重组事件，这些位点可以位于相同或不同的DNA片段。单个loxP位点上，每个13 bp重复序列均被Cre蛋白识别并结合，形成二聚体。然后，两个loxP位点以平行方向排列，从而允许四个Cre蛋白形成四聚体。双链DNA断裂发生在每个loxP位点的核心间隔区内，然后两条链被连接，从而导致相互交换事件发生。
根据loxP位点的位置和方向，有以下三种情景：
1. Inversion：当两个LoxP位点位于一条DNA链上但方向相反时，Cre重组酶能诱导两个LoxP位点间的序列翻转；
2. Deletion：当两个LoxP位点位于一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶能有效地敲除两个LoxP位点间的序列；
3. Translocation：当两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶能诱导两条DNA链发生交换或染色体易位。
However，从以上情景我们也可以看到在Cre酶存在时，三种情景的变化其实是可逆的，那么该如何使这种动态变化达到一种稳定状态呢？
如下图所示，通过引入两对不同的LoxP位点，经过两组LoxP点的两轮重组我们即可达到一种稳定状态，也就可以通过Cre的存在与否来控制基因的表达了。
具体原理如下：
图中的白色箭头对应的是LoxP位点，黑色箭头对应的是Lox-2722位点。这两种位点都能被CRE所识别，并在相同位点间发生重组，而不同位点之间不能发生重组。
发生重组时，方向相反的两个位点之间的序列会被颠倒，而方向相同的两个位点之间的序列被切除。
在图中，假设第一次重组发生在LoxP位点之间，原本反向插入在启动子后的目的基因（不表达），重组后变成顺式结构，能够被启动子驱动表达。第二次的重组发生在两个Lox-2722位点之间，它们的重组导致了中间的LoxP位点丢失，同时只保留下一个Lox-2722位点。最后剩下的Lox-2722和LoxP位点之间不能发生重组，所以整个基因结构便被固定下来。
在这个基础上，也就产生了DO（Cre-off）、DIO（Cre-on）和Cre-Switch（Cre-off/on）。这三种系统中，LoxP序列在同一条载体上，并且方向相同， 只是外源基因的插入方向不同。
◉ DO系统（Cre-off）：插入基因与启动子方向一致，在Cre重组酶存在的情况下会发生重组导致基因方向反向，因此基因不表达，所以称之为Cre-Off；
◉ DIO系统（Cre-on）：插入基因方向与启动子方向相反，在Cre重组酶不存在的情况下不表达，只有当Cre酶存在时，发生重组使基因方向与启动子方向一致，才能使该基因表达，因此该系统称之为Cre-On；
Cre-loxp是一个非常有趣的工具，该工具可用于在转基因动物、胚胎干细胞和（或）组织特异性细胞类型中创建特定的靶向DNA修饰。现已广泛用于控制基因表达、Cre重组酶在各种启动子的控制下或以其可诱导的形式对基因表达进行复杂的时空控制，尤其是在转基因小鼠研究中的应用尤为广泛。
Cre-loxp系统的组成及原理：
Cre-loxp系统由源自P1噬菌体的两个成分组成：Cre重组酶和loxP识别位点。
Cre重组酶最初命名是因为它“引起重组（ causes recombination）”，后来也称之为“环化重组酶（cyclization recombinase）”，它是一个38 kDa的蛋白质，在loxP识别位点负责分子内和分子间的重组。该系统的主要优势在于Cre的作用不依赖于任何其他辅助蛋白或辅因子，因此可广泛用于各类实验中。
LoxP（(Locus of X(cross)-over in P1）则是位于P1噬菌体中的34bp序列，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成，核心序列的不对称赋予了loxP位点方向性，典型的loxP序列为ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT。loxP序列在除P1噬菌体之外的任何已知基因组中都不是天然存在的，并且由于足够长，几乎没有机会随机出现。因此，在DNA序列感兴趣的位置插入loxP位点可以进行非常特殊的操作。
具体原理：
Cre重组酶介导两个loxP位点之间的位点特异性重组事件，这些位点可以位于相同或不同的DNA片段。单个loxP位点上，每个13 bp重复序列均被Cre蛋白识别并结合，形成二聚体。然后，两个loxP位点以平行方向排列，从而允许四个Cre蛋白形成四聚体。双链DNA断裂发生在每个loxP位点的核心间隔区内，然后两条链被连接，从而导致相互交换事件发生。
根据loxP位点的位置和方向，有以下三种情景：
1. Inversion：当两个LoxP位点位于一条DNA链上但方向相反时，Cre重组酶能诱导两个LoxP位点间的序列翻转；
2. Deletion：当两个LoxP位点位于一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶能有效地敲除两个LoxP位点间的序列；
3. Translocation：当两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶能诱导两条DNA链发生交换或染色体易位。
However，从以上情景我们也可以看到在Cre酶存在时，三种情景的变化其实是可逆的，那么该如何使这种动态变化达到一种稳定状态呢？
如下图所示，通过引入两对不同的LoxP位点，经过两组LoxP点的两轮重组我们即可达到一种稳定状态，也就可以通过Cre的存在与否来控制基因的表达了。
具体原理如下：
图中的白色箭头对应的是LoxP位点，黑色箭头对应的是Lox-2722位点。这两种位点都能被CRE所识别，并在相同位点间发生重组，而不同位点之间不能发生重组。
发生重组时，方向相反的两个位点之间的序列会被颠倒，而方向相同的两个位点之间的序列被切除。
在图中，假设第一次重组发生在LoxP位点之间，原本反向插入在启动子后的目的基因（不表达），重组后变成顺式结构，能够被启动子驱动表达。第二次的重组发生在两个Lox-2722位点之间，它们的重组导致了中间的LoxP位点丢失，同时只保留下一个Lox-2722位点。最后剩下的Lox-2722和LoxP位点之间不能发生重组，所以整个基因结构便被固定下来。
在这个基础上，也就产生了DO（Cre-off）、DIO（Cre-on）和Cre-Switch（Cre-off/on）。这三种系统中，LoxP序列在同一条载体上，并且方向相同， 只是外源基因的插入方向不同。
◉ DO系统（Cre-off）：插入基因与启动子方向一致，在Cre重组酶存在的情况下会发生重组导致基因方向反向，因此基因不表达，所以称之为Cre-Off；
◉ DIO系统（Cre-on）：插入基因方向与启动子方向相反，在Cre重组酶不存在的情况下不表达，只有当Cre酶存在时，发生重组使基因方向与启动子方向一致，才能使该基因表达，因此该系统称之为Cre-On；
